在自身免疫、免疫缺陷和癌癥中，受刺激的 T 細(xì)胞中細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)可能會(huì)被破壞。刺激依賴(lài)性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)需要功能喪失和功能獲得研究，這在人類(lèi)原代細(xì)胞中一直具有挑戰(zhàn)性。通過(guò)報(bào)告人類(lèi)原代 T 細(xì)胞中的全基因組 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和干擾 (CRISPRi) 篩選，以識(shí)別控制白介素-2 (IL-2) 和干擾素-γ (IFN-γ) 產(chǎn)生的基因網(wǎng)絡(luò)。

CRISPR 激活與干擾篩選技術(shù)概述

  《科學(xué)》雜志中關(guān)于CRISPR 激活、篩選有新進(jìn)展，CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干擾 (CRISPRi) 篩選是測(cè)試基因功能得失的強(qiáng)大工具，但它們的使用在很大程度上僅限于永生化細(xì)胞系。Smite等人報(bào)告了一種優(yōu)化方法，使他們能夠?qū)θ祟?lèi)原代 T 細(xì)胞進(jìn)行全基因組 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選。然后，這種方法被用來(lái)檢查調(diào)節(jié)關(guān)鍵治療相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生的基因。然后將合并的 CRISPRa 擾動(dòng)與單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (CRISPRa Perturb-seq) 相結(jié)合，使他們能夠探究細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑如何控制 T 細(xì)胞活化并編程為不同的活化后狀態(tài).
人類(lèi) T 細(xì)胞對(duì)抗原刺激的反應(yīng)，包括細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對(duì)健康的免疫功能至關(guān)重要，并且可能在自身免疫、免疫缺陷和癌癥中失調(diào)。系統(tǒng)地了解調(diào)節(jié) T 細(xì)胞激活與功能獲得和功能喪失基因擾動(dòng)的調(diào)節(jié)劑將提供對(duì)疾病途徑的更多見(jiàn)解，并為設(shè)計(jì)下一代免疫療法提供更多機(jī)會(huì)。

CRISPR 激活與干擾篩選的基本原理

盡管 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干擾 (CRISPRi) 篩選是在永生化細(xì)胞系中進(jìn)行功能獲得和功能喪失研究的強(qiáng)大工具，但在原代細(xì)胞類(lèi)型中大規(guī)模部署它們一直具有挑戰(zhàn)性。在這里，研究團(tuán)隊(duì)在原代人類(lèi) T 細(xì)胞中開(kāi)發(fā)了一個(gè) CRISPRa 和 CRISPRi 發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，并對(duì)響應(yīng)刺激的細(xì)胞因子產(chǎn)生的功能調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了全基因組篩選。由于 T 細(xì)胞中內(nèi)源白介素-2 (IL-2) 產(chǎn)生或 CD8 中干擾素-γ (IFN-γ) 產(chǎn)生的水平，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選到高和低箱中分離 CRISPRa 擾動(dòng)細(xì)胞池+ T 細(xì)胞。命中包括近端 T 細(xì)胞受體 (TCR) 信號(hào)通路基因，表明這些成分的過(guò)表達(dá)可以克服信號(hào)“瓶頸"并調(diào)節(jié)刺激和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
    使用 CRISPRi 的互惠全基因組功能喪失篩選檢測(cè)到具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能的命中，包括 CRISPRa 遺漏的一些命中。相比之下，CRISPRa 還發(fā)現(xiàn)了可能不需要的命中，在某些情況下，在篩選條件下僅以低水平表達(dá)。核因子 κ B (NF-κB) 信號(hào)通路對(duì) IFN-γ 產(chǎn)生的調(diào)節(jié)有力地證明了這一點(diǎn)，其中 CRISPRi 確定了所需的 TCR-NF-κB 信號(hào)通路（包括MALT1和BCL10）。CRISPRa 選擇性地檢測(cè)到一組也通過(guò) NF-kB 發(fā)出信號(hào)的腫瘤壞死因子超家族受體，包括 4-1BB、CD27、CD40 和 OX40。在他們的實(shí)驗(yàn)條件下，這些受體并不是單獨(dú)信號(hào)傳導(dǎo)所必需的，但在過(guò)度表達(dá)時(shí)可以促進(jìn) IFN-γ。因此，CRISPRa 和 CRISPRi 在功能性細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑的全面發(fā)現(xiàn)方面相互補(bǔ)充。陣列 CRISPRa 擾動(dòng)驗(yàn)證了關(guān)鍵命中對(duì) CD4 +和 CD8 + T 細(xì)胞的影響。他們還通過(guò)測(cè)量一組分泌的細(xì)胞因子和趨化因子，評(píng)估了單個(gè) CRISPRa 擾動(dòng)如何更廣泛地重新編程 IL-2 和 IFN-γ 之外的細(xì)胞因子產(chǎn)生。


新平臺(tái)的開(kāi)發(fā)與支持
   Smite團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)了一個(gè)平臺(tái)，用于在原代人類(lèi) T 細(xì)胞中結(jié)合單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 讀數(shù) (CRISPRa Perturb-seq) 進(jìn)行合并 CRISPRa 擾動(dòng)。他們使用 CRISPRa Perturb-seq 對(duì)由 70 個(gè)全基因組篩選命中和對(duì)照引起的單細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行深度分子表征，以揭示細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑如何調(diào)節(jié) T 細(xì)胞活化并將細(xì)胞編程為不同的刺激響應(yīng)狀態(tài)。
    他們的研究證明了一個(gè)強(qiáng)大的平臺(tái)，用于在原代人類(lèi) T 細(xì)胞中大規(guī)模匯集 CRISPRa 和 CRISPRi。成對(duì)的 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選能夠?qū)梢哉{(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生的基因網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全面的功能定位。通過(guò)陣列表型分析和匯集的 scRNA-seq 方法對(duì) CRISPRa 命中進(jìn)行跟蹤，可以對(duì)關(guān)鍵篩選命中進(jìn)行精確的功能表征，揭示關(guān)鍵擾動(dòng)如何將 T 細(xì)胞調(diào)整到治療相關(guān)狀態(tài)。未來(lái)在原代細(xì)胞中進(jìn)行的 CRISPRa 和 CRISPRi 篩選可以確定改進(jìn)的下一代細(xì)胞療法的目標(biāo)。
研究學(xué)家Arrayed CRISPRa 確認(rèn)了關(guān)鍵命中并啟用了多重分泌組表征，揭示了重塑的細(xì)胞因子反應(yīng)。將 CRISPRa 篩選與單細(xì)胞 RNA 測(cè)序相結(jié)合，可以對(duì)篩選命中進(jìn)行深度分子表征，揭示了擾動(dòng)如何調(diào)節(jié) T 細(xì)胞活化并促進(jìn)以不同細(xì)胞因子表達(dá)譜為特征的細(xì)胞狀態(tài)。這些篩選揭示了重新編程關(guān)鍵免疫細(xì)胞功能的基因，這也為免疫療法的設(shè)計(jì)提供參考。

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